Làm thế nào để sử dụng siêu âm để phá vỡ tế bào và chiết xuất DNA / RNA?

Làm thế nào để sử dụng siêu âm để phá vỡ tế bào và chiết xuất DNA / RNA?

Siêu âm là một công nghệ hiệu quả và thường được sử dụng trong phá vỡ tế bào và chiết xuất axit nucleic (DNA / RNA).Nguyên tắc cốt lõi của nó là sử dụng hiệu ứng hố và rung động cơ học để phá hủy cấu trúc tế bào và giải phóng các chất bên trongSau đây là một lời giải thích về cơ chế cụ thể, quy trình nộp đơn và các biện pháp phòng ngừa chính:

I. Nguyên tắc và quy trình siêu âm để phá vỡ tế bào
Cốt lõi của sự phá vỡ tế bào là phá hủy màng tế bào (tế bào động vật) hoặc tường tế bào + màng tế bào (cây, vi khuẩn, nấm, v.v.) để giải phóng các chất nội tế (như axit nucleic,protein, nội tạng, v.v.). siêu âm đạt được quá trình này thông qua các cơ chế sau:
1Nguyên tắc cơ bản: hiệu ứng cavitation
Siêu âm là một sóng cơ học tần số cao với tần số cao hơn 20kHz. Khi đầu dò siêu âm (máy khuếch đại của chất phá vỡ siêu âm) được đưa vào một mẫu chất lỏng chứa tế bào,rung động tần số cao (thường là 15-50kHz) được tạo ra, gây ra cavitation trong môi trường lỏng:

Động túng tần số cao gây ra một số lượng lớn bong bóng nhỏ (bong bóng hố), các bong bóng này mở rộng và nén nhanh chóng dưới sự thay đổi áp suất.và cuối cùng nổ tung mạnh mẽ (sụp đổ).
Khi bong bóng vỡ, năng lượng ngay lập tức khổng lồ (nhiệt độ cao địa phương, áp suất cao và sóng giật mạnh) sẽ được giải phóng.và lực tác động được tạo ra sẽ trực tiếp xé cấu trúc màng của tế bào (màng tế bào, thành tế bào) để đạt được sự phân mảnh tế bào.
2Hiệu ứng phụ: rung động cơ học và lực cắt
Các rung động cơ học tần số cao của siêu âm cũng sẽ trực tiếp tạo ra lực cắt và lực ma sát trên các tế bào, tiếp tục giúp phá hủy cấu trúc tế bào,đặc biệt là cho các tế bào có thành tế bào dày (như nấm và tế bào thực vật).
3Quá trình phân mảnh (lấy thí nghiệm làm ví dụ)
Lấy dung dịch tế bào để được điều trị (chẳng hạn như chất lỏng nuôi cấy vi khuẩn, mô đồng bào, v.v.) vào ống ly tâm hoặc bình, chèn đầu dò siêu âm (hông),và các đầu dò cần phải được đắm trong chất lỏng nhưng không tiếp xúc với các bức tường container.

Bật thiết bị siêu âm và đặt các tham số (năng lượng, thời gian, v.v.): rung động tần số cao tạo ra bong bóng hố trong chất lỏng,và lực va chạm được tạo ra bởi sự vỡ của bong bóng trực tiếp phá hủy cấu trúc tế bào và giải phóng các chất nội tế bào (bao gồm cả axit nucleic, protein, chất chuyển hóa, v.v.).
2Ứng dụng cụ thể của siêu âm trong chiết xuất DNA / RNA
Các bước cốt lõi của chiết xuất DNA / RNA bao gồm: phá vỡ tế bào để giải phóng axit nucleic → loại bỏ tạp chất (protein, lipid, polysaccharides, v.v.) → thanh lọc axit nucleic.Vai trò của siêu âm chủ yếu tập trung vào bước đầu tiên - phá vỡ tế bào hiệu quả và giải phóng axit nucleicCác kịch bản ứng dụng cụ thể và lợi thế là như sau:
1Các loại mẫu phù hợp
Siêu âm phù hợp để chiết xuất axit nucleic của một loạt các mẫu, bao gồm:

Thiên vật (như gan, cơ): cần phải được cắt thành những miếng nhỏ trước, siêu âm có thể nhanh chóng phá vỡ các tế bào và giải phóng axit nucleic;
Vi khuẩn / nấm: các thành tế bào tương đối cứng, các phương pháp truyền thống (như điều trị lysozyme) không hiệu quả và siêu âm có thể phá hủy các thành tế bào thông qua tác dụng hố mạnh;
Các tế bào được nuôi dưỡng (tế bào dính hoặc bị treo): treo trực tiếp và sau đó siêu âm, không cần điều trị trước phức tạp;
Thiên thực vật: chứa cellulose và pectin, siêu âm có thể giúp phá vỡ thành tế bào và giải phóng nội dung tế bào.
2Các thông số chính trong hoạt động (tác động đến chất lượng axit nucleic)
Điều trị siêu âm đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ các thông số để tránh sự phân hủy axit nucleic hoặc phân mảnh quá mức (tác động đến các thí nghiệm tiếp theo, chẳng hạn như PCR, trình tự, v.v.):

Sức mạnh: thường là 50-300W (được điều chỉnh theo loại mẫu, chẳng hạn như vi khuẩn đòi hỏi sức mạnh cao hơn).và năng lượng quá thấp sẽ dẫn đến sự phân mảnh không đủ.
Thời gian làm việc / khoảng thời gian: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
Tổng thời gian điều trị: Tùy thuộc vào mẫu (chẳng hạn như 1-3 phút cho tế bào động vật và 3-5 phút cho vi khuẩn).
Kiểm soát nhiệt độ: tắm băng trong suốt quá trình (các mẫu được đặt trên băng), vì quá trình siêu âm sẽ tạo ra nhiệt (hiệu ứng hố kèm theo nhiệt độ cao tại địa phương),Nhiệt độ thấp có thể ức chế hoạt động nuclease và bảo vệ sự ổn định axit nucleic.

3Lợi ích và biện pháp phòng ngừa
Ưu điểm
Hiệu quả cao: Nhanh hơn các phương pháp truyền thống (như nghiền, đông lạnh và tan chảy nhiều lần, thủy phân enzym) (thường hoàn thành trong vòng vài phút) và gián đoạn kỹ lưỡng hơn;
Thiện diện: Áp dụng cho nhiều loại mẫu khác nhau (động vật, thực vật, vi sinh vật, v.v.);
Dễ sử dụng: Không cần các chất phản ứng phức tạp, chỉ cần các dụng cụ siêu âm và thiết bị ly tâm cơ bản.
Các biện pháp phòng ngừa
Tránh bong bóng: Nếu có nhiều bong bóng trong mẫu, hiệu quả của hiệu ứng hố sẽ giảm và đầu dò có thể quá nóng.Đảm bảo rằng đầu dò được chìm hoàn toàn trong chất lỏng (mức độ chất lỏng là khoảng 1-2cm);
Inhibition nuclease: Sau khi phá vỡ, dung dịch phân giải (bao gồm EDTA, chất tẩy rửa, v.v.) nên được thêm vào kịp thời để ức chế nuclease nội bào (chẳng hạn như RNase dễ dàng phá hủy RNA);
Kích thước mẫu: Khối lượng xử lý đơn không nên quá lớn (thường ≤ 5mL), nếu không phân phối năng lượng siêu âm sẽ không đồng đều và hiệu ứng gián đoạn sẽ thay đổi rất nhiều.

Tóm lại
Siêu âm có hiệu quả phá vỡ các tế bào thông qua hiệu ứng hố và rung động cơ học, cung cấp một "bước giải phóng" quan trọng cho việc chiết xuất DNA / RNA.thời gian và nhiệt độ để phá vỡ hoàn toàn các tế bào trong khi tối đa hóa sự bảo vệ tính toàn vẹn axit nucleicCông nghệ này được sử dụng rộng rãi trong giai đoạn xử lý trước của các thí nghiệm sinh học phân tử (như nhân bản gen, qPCR, phân tích phiên mã, v.v.).) và là một công cụ quan trọng để chiết xuất axit nucleic.